1.1 前言与研究假设#

引言概述： 微塑料（MPs）作为一种新兴的环境污染物，其对人体健康的潜在风险日益受到关注。已有研究证实，微塑料可通过多种途径进入人体并在关键器官蓄积，引发包括代谢紊乱、神经毒性和炎症反应在内的多种病理过程。其中，聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）作为最常见的塑料之一，其衍生的微塑料（PET-MPs）广泛存在于食品包装和日常用品中，使得口腔成为其主要暴露门户。牙周炎是一种由微生物失调和宿主免疫异常驱动的慢性炎症性疾病，环境污染物被认为是其重要的风险因素。然而，PET-MPs在牙周炎发病机制中的具体作用和分子机制尚不明确。

课题假设： 基于上述背景，我们提出以下核心假设：PET-MPs暴露可通过直接作用于牙周组织的关键靶点，诱导细胞氧化应激和促炎反应，从而触发或加剧牙周炎的病理进程。 本研究旨在利用整合多组学分析与实验验证相结合的策略，系统阐明这一过程的分子机制。

1.2 实验材料与方法#

为验证上述假设，本研究采用了“从计算机预测到体外实验验证”的多层次研究策略：

1. 生物信息学与网络毒理学分析：

   • 靶点筛选： 从公共数据库（GEO, GeneCards, OMIM）获取牙周炎相关的差异表达基因（DEGs）；利用化学信息学平台（ChEMBL, SwissTargetPrediction）预测PET-MPs的潜在作用靶点；通过韦恩图分析确定二者的交集靶点。
   • 核心靶点鉴定： 构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络并进行拓扑分析；结合机器学习（随机森林等106种模型）算法，从交集靶点中筛选出对疾病状态最具预测价值的核心靶点基因。
   • 功能富集分析： 对核心靶点进行GO和KEGG通路富集分析，揭示其潜在的生物学功能和信号通路。

2. 分子对接（Molecular Docking）：

   • 利用AutoDock Vina等软件，在原子水平上模拟PET分子与核心靶点蛋白的三维结构结合模式和亲和力，从理论上验证二者直接相互作用的可能性。

3. 体外实验验证：

   • 实验模型： 使用原代培养的人牙龈成纤维细胞（GFs）作为体外研究模型。
   • 材料表征： 通过透射电镜（TEM）、扫描电镜（SEM）和动态光散射（DLS）对所用PET-MPs的形貌、尺寸和表面电位进行表征。
   • 细胞功能实验：
     • 细胞毒性评估： 采用活/死细胞染色法（Calcein-AM/PI）评估不同浓度PET-MPs对GFs存活率的影响。
     • 氧化应激检测： 使用DCFH-DA和MitoSOX探针分别检测细胞总活性氧（ROS）和线粒体ROS水平。
     • 炎症反应分析： 通过免疫荧光（IF）和实时定量PCR（qRT-PCR）检测促炎因子（如IL-1β, TNF-α, iNOS, PGE2）的表达变化。
   • 核心靶点表达验证： 采用qRT-PCR技术，检测在PET-MPs刺激下，GFs中预测的核心靶点基因（如CASP3, KDR, PIM2, MTOR, MAPK14, AKT1, ALPL等）的mRNA表达水平变化。

1.3 结果#

本研究完成了以下工作并获得关键结果：

1. 鉴定出13个核心靶点： 通过生物信息学和机器学习整合分析，从23个交集靶点中筛选出13个连接PET-MPs暴露与牙周炎病理过程的核心靶点。
2. 揭示关键信号通路： 功能富集分析表明，这些核心靶点主要富集于TNF信号通路、VEGF信号通路和C型凝集素受体信号通路等与炎症、免疫应答和血管生成密切相关的通路。
3. 证实直接相互作用潜力： 分子对接结果显示，PET分子与大部分核心靶点蛋白（如KDR, PTGS2, MAPK14等）具有良好的结合亲和力（结合能 < -5.0 kcal/mol），支持了直接作用的假设。
4. 验证PET-MPs的细胞毒性和氧化应激效应： 体外实验证实，高浓度PET-MPs（≥50 µg/mL）可显著降低GFs细胞活力，并呈剂量依赖性地诱导细胞内总ROS和线粒体ROS的产生。
5. 证实PET-MPs的促炎效应： PET-MPs暴露显著上调了GFs中多种促炎介质（IL-1β, TNF-α, iNOS）的表达。
6. 验证核心靶点的表达变化： qRT-PCR结果显示，PET-MPs处理后，GFs中多个核心靶点的表达发生显著变化，其中促凋亡和炎症相关基因CASP3, KDR, PIM2, PTGS2, MTOR, MAPK14表达上调，而与细胞存活和矿化相关的AKT1, ALPL表达下调，与预测分析的趋势基本一致。

1.4 讨论#

本研究基于上述结果展开了深入讨论，形成了完整的逻辑闭环：

1. 整合分析的可靠性与创新性： 本研究成功整合了网络毒理学、机器学习和实验验证，构建了一个从宏观污染物暴露到微观分子机制的系统性研究框架。该框架不仅高效地锁定了关键分子靶点，也为环境健康领域的研究提供了新的范式。
2. 机制阐述：氧化应激-炎症串扰是核心机制： 讨论明确指出，PET-MPs诱导牙周炎的核心机制在于其触发了氧化应激与炎症反应之间的恶性循环。PET-MPs进入牙龈细胞后，通过直接或间接方式（如干扰线粒体功能）导致ROS大量产生。过量的ROS作为信号分子，激活了下游的炎症通路（如通过MAPK14调控的TNF通路），促进了IL-1β、TNF-α等炎症因子的释放。这些炎症因子反过来又会加剧氧化应激，最终导致细胞损伤、凋亡（CASP3上调）和组织破坏，表现为牙周炎的临床特征。
3. 核心靶点的生物学意义： 讨论中详细解析了几个关键靶点的作用。例如，**KDR (VEGFR2)**的上调提示了病理性血管生成可能参与其中；PTGS2 (COX-2)的上调直接关联到促炎前列腺素的合成；而AKT1的下调则意味着细胞的生存信号被抑制。这些分子的协同作用共同构成了PET-MPs的致病网络。
4. 研究的意义与展望： 本研究首次系统性地揭示了PET-MPs与牙周炎之间的分子联系，为评估微塑料的口腔健康风险提供了直接证据和理论基础。研究结果提示，所发现的核心靶点（如CASP3, KDR, AKT1等）可作为潜在的诊断生物标志物和治疗干预靶点。未来的研究应进一步在动物模型中验证该机制，并探讨不同物理化学性质的微塑料对牙周健康的差异化影响。

2.1 论文概览#

• 题目: Integrated network toxicology, machine learning, molecular docking and experimental validation to elucidate mechanism of polyethylene terephthalate microplastics inducing periodontitis (整合网络毒理学、机器学习、分子对接到实验验证，阐明聚对苯二甲酸乙二醇酯微塑料诱发牙周炎的机制)
• 期刊: Environment International
• 核心结论: 这篇论文通过一个“从计算机预测到实验室验证”的完整流程，证明了PET微塑料（PET-MPs）可以通过诱导牙龈成纤维细胞的氧化应激和炎症反应，从而引发或加剧牙周炎。

2.2 核心科学问题#

这篇论文旨在回答两个层层递进的问题：

1. 现象问题: PET微塑料（一种常见的塑料污染物）暴露是否与牙周炎（一种常见的口腔疾病）有关？
2. 机制问题: 如果有关，其底层的分子生物学机制是什么？也就是说，PET微塑料是如何在细胞和分子水平上“搞破坏”从而导致牙周炎？

2.3 研究思路与方法拆解#

这篇论文最大的亮点在于其清晰的研究逻辑链，堪称现代生物医学研究的典范。对于新手来说，理解这个“套路”比记住具体结论更重要。整个过程就像一个从宏观到微观、从宽泛到精准的“漏斗”。

2.4 这篇论文的亮点与启示#

1. 清晰的多学科整合范式: 完美展示了生物信息学 -> 网络毒理学 -> 机器学习 -> 分子模拟 -> 实验验证这一套组合拳。这个框架可以被广泛应用到环境毒理、药物研发等多个领域。
2. 严密的逻辑链: 每一步都以前一步的结果为基础，层层递进，从海量数据中精准定位到核心机制，说服力极强。
3. “干湿结合”的典范: 计算分析（干）为实验（湿）指明了方向，节省了盲目试错的时间和成本；实验验证（湿）则为计算结果提供了最终的证据，使结论更加可靠。

2.5 总结#

• 研究思路: 在面对一个“A是否导致B，机制是什么”的科学问题时，可以借鉴本文的“漏斗式”研究策略。
• 工具应用: 了解了GEO, GeneCards, STRING, DAVID (GO/KEGG分析工具) 等常用生物信息学数据库和工具的实际用途。
• 思维模式: 认识到现代生物医学研究不再是单纯的实验堆砌，而是数据驱动的、预测与验证相结合的科学探索过程。
• 论文写作: 本文的结构安排（从预测到验证）本身就是一个很好的写作模板，逻辑清晰，易于读者理解。

2.6 思考与疑问#

• 暴露剂量问题: 实验中使用的PET-MPs浓度是否能真实反映人体的实际暴露水平？这是一个需要深入探讨的问题。
• 体内环境的复杂性: 本研究是在体外细胞水平进行的。在真实的口腔环境中，还存在唾液、微生物菌群等复杂因素，它们与微塑料的相互作用可能会影响最终结果。
• 微塑料的物理化学性质: 不同大小、形状、老化程度的微塑料其毒性效应可能不同，未来可以进一步研究。

3.1 报告摘要#

本报告旨在对论文《Integrated network toxicology, machine learning…》中关于“基因组筛查共鉴定出707个差异表达转录本”的核心发现进行计算复现。我们使用R语言及limma包，严格遵循论文方法学章节所述的筛选标准（adjusted p < 0.05 和 |log2 Fold Change| > 1.5）对公共数据集GSE16134进行分析。

核心结论：我们的复现分析鉴定出 137个 差异表达基因（DEGs），其中128个上调，9个下调。此结果与论文报告的707个DEGs存在显著差异。 深入分析表明，差异最可能源于论文方法学部分对logFC阈值表述的歧义或笔误，而非分析流程本身的问题。

3.2 复现目标#

• 论文发现: “Genomic screening identified 707 differentially expressed transcripts, comprising 370 upregulated and 337 downregulated transcripts.” (基因组筛查共鉴定出707个差异表达转录本，包括370个上调和337个下调转录本) (见论文 Fig 1B)。
• 数据集: GEO accession: GSE16134.
• 筛选标准 (据论文): adjusted p < 0.05 且 |log2 Fold Change| > 1.5。

3.3 复现方法与代码#

我们使用了标准的差异表达分析流程，步骤清晰、方法正确。

1
# --- 步骤 1: 安装和加载必要的R包 ---
2
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE)) {
3
    install.packages("BiocManager")
4
}
5
packages <- c("GEOquery", "limma", "dplyr", "ggplot2")
6
for (pkg in packages) {
7
    if (!requireNamespace(pkg, quietly = TRUE)) {
8
        BiocManager::install(pkg)
9
    }
10
}
11
library(GEOquery)
12
library(limma)
13
library(dplyr)
14
library(ggplot2)
15

16
# --- 步骤 2: 智能加载数据 ---
17
gse_file <- "GSE16134.RData"
18
if (file.exists(gse_file)) {
19
  cat("本地数据文件 '", gse_file, "' 已存在，正在快速加载...\n", sep = "")
20
  load(gse_file)
21
} else {
22
  cat("本地数据文件不存在，开始从GEO下载 (仅此一次)...\n")
23
  options(timeout = max(600, getOption("timeout")))
24
  gse_list <- getGEO("GSE16134", GSEMatrix = TRUE, AnnotGPL = FALSE)
25
  gse <- gse_list[[1]]
26
  save(gse, file = gse_file)
27
  cat("数据下载完成，并已保存到 '", gse_file, "'。\n", sep = "")
28
}
29

30
# --- 步骤 3: 准备数据进行分析 ---
31
expr_matrix <- exprs(gse)
32
pdata <- pData(gse)
33
groups <- ifelse(grepl("Healthy", pdata$characteristics_ch1, ignore.case = TRUE), "Healthy", "Periodontitis")
34
groups <- factor(groups, levels = c("Healthy", "Periodontitis"))
35

36
cat("\n数据分组情况:\n")
37
print(table(groups))
38

39
# --- 步骤 4: 使用 limma 进行差异表达分析 ---
40
design <- model.matrix(~ 0 + groups)
41
colnames(design) <- levels(groups)
42
contrast_matrix <- makeContrasts(Periodontitis - Healthy, levels = design)
43
fit <- lmFit(expr_matrix, design)
44
fit_contrast <- contrasts.fit(fit, contrast_matrix)
45
fit_bayes <- eBayes(fit_contrast)
46

47
# --- 步骤 5: 筛选并报告结果 ---
48
all_genes_results <- topTable(fit_bayes, number = Inf, sort.by = "P")
49
adj_p_value_threshold <- 0.05
50
logfc_threshold <- 1.5
51
significant_degs <- all_genes_results %>%
52
  filter(adj.P.Val < adj_p_value_threshold & abs(logFC) > logfc_threshold)
53
upregulated_count <- sum(significant_degs$logFC > logfc_threshold)
54
downregulated_count <- sum(significant_degs$logFC < -logfc_threshold)
55
total_degs_count <- nrow(significant_degs)
56

57
# 打印最终结果
58
cat("\n----------------- 分析结果 -----------------\n")
59
cat("总共鉴定出的差异表达基因 (DEGs) 数量:", total_degs_count, "\n")
60
cat("上调基因数量:", upregulated_count, "\n")
61
cat("下调基因数量:", downregulated_count, "\n")
62
cat("\n结论：复现结果与论文报告存在显著差异。\n")
63
cat("--------------------------------------------\n")
64

65
# --- 步骤 6: 绘制火山图 ---
66
all_genes_results <- all_genes_results %>%
67
  mutate(significance = case_when(
68
    adj.P.Val < adj_p_value_threshold & logFC > logfc_threshold ~ "Upregulated",
69
    adj.P.Val < adj_p_value_threshold & logFC < -logfc_threshold ~ "Downregulated",
70
    TRUE ~ "Not Significant"
71
  ))
72
volcano_plot <- ggplot(all_genes_results, aes(x = logFC, y = -log10(adj.P.Val), color = significance)) +
73
  geom_point(alpha = 0.5, size = 1.2) +
74
  scale_color_manual(values = c("Upregulated" = "#d6604d", "Downregulated" = "#4393c3", "Not Significant" = "grey")) +
75
  geom_vline(xintercept = c(-logfc_threshold, logfc_threshold), linetype = "dashed", color = "black") +
76
  geom_hline(yintercept = -log10(adj_p_value_threshold), linetype = "dashed", color = "black") +
77
  labs(
78
    title = "Volcano Plot: Periodontitis vs. Healthy (GSE16134)",
79
    x = "log2 Fold Change",
80
    y = "-log10(Adjusted P-value)"
81
  ) +
82
  theme_bw() +
83
  theme(legend.title = element_blank())
84
print(volcano_plot)

3.4 复现结果#

我们的分析流程确认了以下几点：

1. 样本分组正确: 成功将310个样本分为69个健康对照组和241个牙周炎患者组，与论文样本量一致。
2. 分析流程标准: 使用的limma包是微阵列数据差异分析的“金标准”，流程无误。
3. 最终结果:
   • 总差异表达基因数量: 137
   • 上调基因数量: 128
   • 下调基因数量: 9

代码运行结果:

结论: 我们的计算结果（137个）与论文报告的（707个）不一致。

3.5 差异分析与探讨：为何结果不同？#

既然代码和流程都是正确的，那么问题一定出在对“标准”的理解或数据预处理上。以下是导致差异的最可能原因：

• 不同的预处理流程: 论文作者可能从更原始的数据（如.CEL文件）开始，使用了与GEO数据库中已处理数据不同的标准化和背景校正方法。这也会导致最终统计值的差异。
• 核心推测：论文对 logFC 阈值的表述存在笔误或歧义。: 在生物信息学分析中，log2 Fold Change > 1.5 是一个 极其严格 的标准。它代表基因表达量差异要达到 2^1.5 ≈ 2.83 倍。而一个更常见、也更常规的标准是 Fold Change > 1.5，换算成log2单位后，即 log2 Fold Change > log2(1.5) ≈ 0.585。
• 不同的基因注释: 使用的探针到基因的注释文件版本不同，可能导致少量基因的统计差异，但不足以解释从137到707的巨大差距。

3.6 零代码分析平台验证#

为了进一步验证，我们使用了零代码在线分析平台对GSE16134进行分析。当调整logFC阈值时，我们发现：

• 当|log2FC| > 0.585 (即FC > 1.5)时，可以得到约680个差异表达基因。
• 这个数字（680个）非常接近论文报告的707个。微小的差异可能来源于平台使用的具体标准化方法或基因注释版本。

3.7 最终结论#

1. 直接复现失败: 严格按照论文方法章节字面描述的标准（|log2FC| > 1.5），无法复现其报告的707个差异表达基因的结果。
2. 最可能的原因是笔误: 论文作者极有可能在方法学部分出现了笔误，将常规的Fold Change > 1.5误写为log2 Fold Change > 1.5。前者（|log2FC| > 0.585）是该领域更常用的标准，且使用该标准复现的结果与论文报告的数据高度吻合。
3. 对后续分析的影响: 尽管初始筛选的基因数量存在差异，但这可能不影响论文的整体结论，因为后续的靶点筛选（取交集、机器学习）会进一步聚焦到最核心的基因上。然而，这一发现强调了在科研中准确描述方法和参数的重要性。